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多肽合成方法

更新時(shí)間:2021-06-18點(diǎn)擊次數(shù):2001
  多肽合成方法:
 
  1.酰基疊氮物法
 
  早在1902年,Theodor Curtius就將?;B氮物法引入到肽化學(xué)中,因此它是最古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中,除了與?;B氨縮合的游離氨基酸和肽以外,氨基酸酯可用于有機(jī)溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是,它不需要增加輔助堿或另一等當(dāng)量的氨基組分來捕獲腙酸。
 
  長期以來,一直認(rèn)為疊氮物法是不發(fā)生消旋的縮合方法,隨著可選擇性裂解的氨基酸保護(hù)基引入,該方法經(jīng)歷了一次大規(guī)模的復(fù)興。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應(yīng)的酯很容易得到。在-10℃的鹽酸中,用等當(dāng)量的亞硝酸鈉使酰肼發(fā)生亞硝化而轉(zhuǎn)化為疊氮化物65,依次洗滌、干燥,然后與相應(yīng)的氨基組分反應(yīng)。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來。 二苯磷?;B氮化物(DPPA)也可以用于?;B氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑,并且使疊氮縮合反應(yīng)可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。因?;B氮化物的熱不穩(wěn)定性,縮合反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度較高時(shí),Curtius重排,即?;B氮轉(zhuǎn)化為異氰酸酯的反應(yīng)成為一個(gè)主要的副反應(yīng),最終導(dǎo)致生成副產(chǎn)物脲。由于反應(yīng)溫度低(如4℃)而導(dǎo)致反應(yīng)速率相當(dāng)慢,使得肽縮合反應(yīng)通常需要幾天才能*。  對(duì)于較長的N端保護(hù)的肽鏈,酯基的肼解一般比較困難,因此,使用正交的N保護(hù)肼衍生物是一種選擇。在肼基的選擇性脫除后,按倒接(backing-off)策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合。
 
  如前所述,雖然疊氮法一直被認(rèn)為是消旋化傾向最小的縮合方法,但在反應(yīng)中,過量的堿會(huì)誘發(fā)相當(dāng)大的消旋。因此,在縮合反應(yīng)期間要避免與堿接觸,例如,氨基組分的銨鹽應(yīng)采用N,N-二異丙胺或N-烷基嗎啉代替三乙胺來中和。
 
  雖然有上述局限性,但該方法仍很重要,尤其對(duì)于片段縮合而言,因?yàn)樵摲椒ň哂休^低的異構(gòu)化傾向,適用于羥基未保護(hù)絲氨酸或蘇氨酸組分時(shí),Nˊ保護(hù)的本行酰肼還具有多種用途。
 
  2.酸酐法
 
  在多肽合成中,最初考慮應(yīng)用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius對(duì)苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應(yīng)中,除獲得苯甲酰氨基乙酸外,還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認(rèn)為,當(dāng)用苯甲酰氯處理時(shí),N-苯甲酰基氨基酸或N-苯甲?;呐c苯甲酸形成了活性中間體不對(duì)稱酸酐。  大約在70年后,Theodor Wieland利用這些發(fā)現(xiàn)將混合酸酐法用于現(xiàn)代多肽合成。目前,除該方法外,對(duì)稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內(nèi)形成的N-羧基內(nèi)酸酐(NCA,Leuchs anhydrides)也用肽縮合。最后應(yīng)該提到,不對(duì)稱酸酐常常參與生化反應(yīng)中的?;磻?yīng)。
 
  3.混合酸酐法
 
  有機(jī)羧酸和無機(jī)酸皆可用于混合酸酐的形成。然而,僅有幾個(gè)得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用,多數(shù)情況下,采用氯甲酸烷基酯。
 
  由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐,其氨解反應(yīng)的區(qū)域選擇性依賴依賴于兩個(gè)互相競爭的羰基的親電性和(或)空間位阻。在由N保護(hù)的氨基酸羧酸鹽(羧基組分)和氯甲酸烷基酯(活化組分,例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐時(shí),親核試劑胺主要進(jìn)攻氨基酸組分的羧基,形成預(yù)期的肽衍生物,并且釋放出游離酸形式的活性成分。當(dāng)應(yīng)用氯甲酸烷基酯(R1=異丁基、乙基等)時(shí),游離的單烷基碳酸不穩(wěn)定,立即分解為二氧化碳和相應(yīng)的醇。然而,對(duì)于親核進(jìn)攻的區(qū)域選擇性,也有一些相反的報(bào)道,產(chǎn)物為氨基甲酸酯和原來的N保護(hù)氨基酸組分。  為了形成混合酸酐,將N保護(hù)的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙腈、乙酸乙酯或DMF中,用等當(dāng)量的三級(jí)堿(N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉等)處理。然后,在-15℃--5℃,劇烈攪拌的同時(shí)加入氯甲酸烷基酯以形成不對(duì)稱酸酐(活化)。經(jīng)短時(shí)間活化后,加入親核性氨基酸組分。如果作為銨鹽使用(需要更多的堿),必須避免堿的過量使用。如果嚴(yán)格按照以上的反應(yīng)條件,混合酸酐法很容易進(jìn)行,是*的縮合方法之一。
 
  4.對(duì)稱酸酐法
 
  Nα-?;被岬膶?duì)稱酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法相反,它與胺親核試劑的反應(yīng)沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性。但肽縮合產(chǎn)率最高,為50%(以羧基組分計(jì))。
 
  雖然由對(duì)稱酸酐氨解形成的游離Nα-酰基氨基酸可以和目標(biāo)肽一起,通過飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收,但在最初,這種方法的實(shí)用價(jià)值極低。對(duì)稱酸酐可以用Nα-保護(hù)氨基酸與光氣,或方便的碳二亞胺反應(yīng)制得。兩當(dāng)量的Nα-保護(hù)氨基酸與-當(dāng)量的碳二亞胺反應(yīng)有利于對(duì)稱酸酐的形成,對(duì)稱酸酐可以分離出來,也可不經(jīng)純化而直接用于后面的縮合反應(yīng)。基于Nα-烷氧羰基氨基酸的對(duì)稱酸酐對(duì)水解穩(wěn)定,可采用類似上述純化混合酸酐的方法進(jìn)行純化。
 
  由于Boc-保護(hù)氨基酸的商品化和合理的價(jià)格,在肽鏈的逐步延長中,使用對(duì)稱酸酐法日益受到重視。雖然可以買到晶狀的對(duì)稱酸酐,但原位制備仍然是一種不錯(cuò)的選擇。
 
  5.碳二亞胺法
 
  碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合。在該類化合物中N,Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對(duì)便宜,而且可溶于肽合成常用的溶劑。在肽鍵形成期間,碳二亞胺轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的脲衍生物,N,Nˊ-二環(huán)己基脲可以從反應(yīng)液中沉淀出來。顯然,碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同,使肽合成能在含水介質(zhì)進(jìn)行。經(jīng)幾個(gè)課題組的大量研究,確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合反應(yīng)機(jī)理,羧酸根離子加成到質(zhì)子化的碳二亞胺,形成高活性的O-?;澹浑m然還沒有分離出這個(gè)中間體,但通過非常類似的穩(wěn)定化合物推斷了它的存在。O-酰基脲與氨基組分反應(yīng),產(chǎn)生被保護(hù)的肽和脲衍生物。或者,與質(zhì)子化形式處于處于平衡狀態(tài)的O-?;愲?被第二個(gè)羧酸酯親核進(jìn)攻,產(chǎn)生對(duì)稱的氨基酸酐和N,Nˊ-二取代脲。前者與氨基酸反應(yīng)得到肽衍生物和游離氨基酸。在堿催化下,使用DCC的副反應(yīng)使?;鶑漠愲逖踉酉虻愚D(zhuǎn)移,產(chǎn)生N-酰基脲71,它不再發(fā)生進(jìn)一步的氨解。不僅過量的堿可催化O-N的?;D(zhuǎn)移,而且堿性的氨基組分或碳二亞胺也可催化該副反應(yīng)。
 
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